瓊脂糖凝膠電泳色譜儀是以瓊脂糖凝膠作為載體的電泳技術，廣泛用于核酸研究，為DNA分子及其片段的分子量測定和DNA分子構象分析提供了重要手段。

一、工作原理：

瓊脂糖凝膠電泳中，DNA分子的遷移率與其分子量的常用對數成反比。DNA分子構象對遷移率也有影響，遷移率為共價閉環DNA＞直線DNA＞開環雙鏈DNA。

在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態。瓊脂糖凝膠電泳中，DNA和RNA從負極向正極移動。

二、瓊脂糖凝膠制備：

瓊脂糖是從瓊脂中精制出來的白色膠狀多糖，是由1，3連接的β－D吡喃半乳糖和1，4連接的3，6脫水β－D吡喃半乳糖交替而成的中性物質。瓊脂糖由于氫鍵和其它力的作用使其相互盤繞成繩狀瓊脂糖束，而形成大網孔型凝膠。

瓊脂是從海藻中提取出來的多糖體，主要由瓊脂糖（約占80%）和瓊脂膠組成。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，從瓊脂膠中脫去硫酸酯基和丙酮酸酯基可獲得瓊脂糖。瓊脂膠和瓊脂糖的結構相似，但由于瓊脂膠含硫酸根和羧基，凝膠能力差；瓊脂糖中存在極微量的硫酸根和丙酮酸酯基取代電離基團，在電場作用下能產生較強的電滲；硫酸根可與某些蛋白質作用，從而影響電泳速度和分離效果。因此，在瓊脂糖制備過程中需要把瓊脂膠盡量除去。質量較好的瓊脂糖的硫酸根含量較低，通常小于0.2%，電滲較小。

三、瓊脂糖凝膠種類：

1、高純度瓊脂糖凝膠：適用于DNA的分離和鑒定。

2、高強度瓊脂糖凝膠：適用于大分子的分離或濃度小于0.5%時使用。

3、高篩分瓊脂糖凝膠：主要用于100～1200bp的小片段DNA的分離，可分辨相差4個堿基的DNA。

4、低熔點瓊脂糖凝膠（65℃）：適用于回收DNA段，保持凝膠中回收樣品的穩定性和活性。

四、瓊脂糖凝膠性能指標：

瓊脂糖凝膠性能指標有電滲、膠凝溫度、熔化溫度、凝膠強度和脫水收縮作用等。

1、電滲：

電滲是瓊脂糖凝膠電泳中由多糖骨架上的帶電基團引起的，主要是由硫酸酯和丙酮酸鹽引起，這些陰離子基團被固定在載體中，相應的陽離子與其結合水一起向負極移動。

2、膠凝溫度：

將瓊脂糖凝膠在溶液中加熱至90℃溶解后降溫，由液態轉變為固態時的溫度即為凝固點，稱為膠凝溫度。

一般在35～43℃。

3、熔化溫度：

將凝固的瓊脂糖凝膠由固態轉變為液態時的溫度即為熔化點，稱為熔化溫度。

一般在75～90℃。

4、凝膠強度：

凝膠強度是指每平方厘米的瓊脂糖凝膠所能承受的重量。

凝膠強度與凝膠濃度成正比。

5、脫水收縮作用：

脫水收縮作用是指由于瓊脂糖凝膠骨架收縮使一部分液體從凝膠中分離出來的現象。

五、不同濃度的瓊脂糖凝膠分離DNA段的范圍：

1、凝膠總濃度：0.3%

dsDNA段的分離范圍：5～60kb

2、凝膠總濃度：0.6%

dsDNA段的分離范圍：1～20kb

3、凝膠總濃度：0.7%

dsDNA段的分離范圍：0.8～10kb

4、凝膠總濃度：0.9%

dsDNA段的分離范圍：0.5～7kb

5、凝膠總濃度：1.2%

dsDNA段的分離范圍：0.4～6kb

6、凝膠總濃度：1.5%

dsDNA段的分離范圍：0.2～3kb

7、凝膠總濃度：2%

dsDNA段的分離范圍：0.1～2kb

六、特點：

1、優點：

（1）瓊脂糖凝膠屬于大孔膠，可分析分子量為10⁷的大分子，但分辨率低于聚丙烯酰胺凝膠電泳。這種大孔特性有利于免疫電泳和微量制備。

瓊脂糖形成凝膠后孔徑的大小取決于瓊脂糖凝膠濃度，瓊脂糖凝膠濃度與平均孔徑的關系如下：

1）瓊脂糖凝膠濃度為0.075%時，平均孔徑為800nm，可分析百萬分子量的大分子。

2）瓊脂糖凝膠濃度為0.16%時，平均孔徑為500nm。

3）瓊脂糖凝膠濃度為1%時，平均孔徑為150nm。

4）瓊脂糖凝膠濃度為2%時，平均孔徑為20nm。

（2）物理化學性質穩定，結構均勻，含水量大（98%～99%），近似自由電泳，對蛋白質吸附極微，無拖尾現象，分辨率高，電泳圖清晰，重復性好。

（3）機械強度較高，可在1%或更低濃度下使用且在這種濃度下仍有篩分和抗對流作用。制成干膜可長期保存。

（4）瓊脂糖無毒，生物中性，不與生物材料結合。

（5）具有熱可逆性，膠凝過程不用催化劑。

（6）因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂糖凝膠的電滲。

（7）電泳操作、染色、脫色簡單快速，背景色較低，便于定量測定。

（8）透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色，放射自顯影靈敏度高。

（9）不吸收紫外光，可直接用紫外吸收法定量測定。

（10）低熔點瓊脂糖凝膠回收樣品容易。

2、缺點：

（1）易破碎，濃度不能太低。

（2）易被細菌污染，不易保存，要用前配制。

（3）瓊脂糖凝膠載體上的區帶易擴散，電泳后必須立即固定染色。

（4）與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，分子篩作用小，區帶少。

七、應用：

由于瓊脂糖凝膠孔徑相當大，對大多數蛋白質來說，其分子篩作用微不足道，廣泛用于核酸的研究， 適用于分離200～50kb DNA段。

   

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